ELISA實(shí)驗(yàn)組織提取物制備指南：從樣本到可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵第一步

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是檢測(cè)組織樣本中特定蛋白（如細(xì)胞因子、信號(hào)蛋白、酶等）表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。然而，實(shí)驗(yàn)的成敗很大程度上取決于起始樣本——組織提取物的制備質(zhì)量。一份保存完好、目標(biāo)蛋白完整且無(wú)干擾物質(zhì)污染的提取物，是獲得準(zhǔn)確、可重復(fù)ELISA結(jié)果的基石。本文將詳細(xì)介紹組織提取物的標(biāo)準(zhǔn)制備流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：安全與物料

1.  安全第一：
    *   個(gè)人防護(hù)裝備 (PPE)：全程佩戴實(shí)驗(yàn)服、一次性手套（推薦無(wú)粉丁腈手套）、護(hù)目鏡。處理人或動(dòng)物感染性組織時(shí)需在生物安全柜內(nèi)操作。
    *   銳器處理：使用專用銳器盒處理刀片、剪刀等。
    *   化學(xué)品安全：熟悉所用試劑（如蛋白酶抑制劑、PMSF、DTT、離液劑）的MSDS，在通風(fēng)櫥中操作揮發(fā)性或有毒試劑（如PMSF）。
    *   低溫防護(hù)：處理液氮或干冰時(shí)，穿戴低溫手套和面罩。

2.  材料與試劑準(zhǔn)備：
    *   組織樣本：新鮮組織或正確保存（-80°C或液氮）的速凍組織。
    *   預(yù)冷器具：研缽、研杵、勻漿器（探頭式或刀片式）、離心管（1.5mL或15/50mL）、藥匙、鑷子、剪刀、刮刀。關(guān)鍵：使用前將所有接觸樣本的器具（包括勻漿器探頭）在-20°C或冰上預(yù)冷。
    *   預(yù)冷提取緩沖液：
        *   基礎(chǔ)緩沖液：常用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（如RIPA緩沖液：50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40或Triton X-100, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS）或更溫和的NP-40緩沖液（50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40）。緩沖液必須4°C預(yù)冷或置于冰上。
        *   關(guān)鍵添加劑：
            *   蛋白酶抑制劑混合物：廣譜抑制絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶（如EDTA）。使用商品化混合片劑/溶液或自行配制（需包含PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制劑等）。
            *   磷酸酶抑制劑混合物：如果檢測(cè)磷酸化蛋白，必須添加（如NaF、Na3VO4、β-甘油磷酸酯）。
            *   還原劑 (可選)：如DTT（1-5mM）或β-巰基乙醇（1-5mM），用于打斷二硫鍵，使蛋白充分變性溶解。
    *   低溫環(huán)境：冰盒或冰浴，預(yù)冷的離心機(jī)（能達(dá)4°C）。
    *   液氮或干冰：用于速凍新鮮組織（強(qiáng)烈推薦）。

二、組織提取物制備詳細(xì)流程

核心原則：全程低溫、快速操作、充分裂解、去除雜質(zhì)。

1.  組織取材與稱重 (全程在冰上操作)：
    *   新鮮組織：離體后立即置于預(yù)冷的PBS或生理鹽水中短暫漂洗，去除表面血液和雜質(zhì)。用濾紙吸干多余液體?？焖賹⒔M織分割成小塊（< 0.5cm3），精確稱重（記錄重量，用于后續(xù)濃度計(jì)算）。立即投入液氮或干冰中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80°C保存，或立即進(jìn)行下一步勻漿。
    *   凍存組織：從-80°C或液氮中取出，避免解凍。在冰上操作，用預(yù)冷的研缽和研杵，加入少量液氮，將組織迅速研磨成細(xì)粉末（粉末狀利于后續(xù)充分裂解）。在粉末即將融化前，用預(yù)冷的藥匙快速將粉末刮入裝有預(yù)冷裂解緩沖液的離心管中。注意：研磨過(guò)程組織必須保持冰凍狀態(tài)。

2.  加入裂解緩沖液：
    *   根據(jù)組織重量，按合適的比例加入預(yù)冷的裂解緩沖液。常用比例范圍是 1:5 到 1:10 (w/v), 即1g組織加入5-10mL緩沖液。具體比例需根據(jù)組織類型（如腦組織需更多緩沖液）、目標(biāo)蛋白豐度和實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化。記錄加入的緩沖液體積。
    *   加入緩沖液后，立即渦旋振蕩或輕柔顛倒混勻數(shù)次，確保組織粉末/小塊被緩沖液完全浸沒(méi)。

3.  組織勻漿/裂解 (全程在冰上操作)：
    *   探頭式勻漿器法 (最常用)：
        *   將離心管置于冰水混合物中。
        *   插入預(yù)冷的勻漿器探頭，確保探頭浸入液面下但避免觸碰管底和管壁過(guò)猛。
        *   開(kāi)啟勻漿器，采用間歇式勻漿（如工作5-10秒，停10-15秒，讓樣本冷卻），全程在冰上操作?？倓驖{時(shí)間通常為30-90秒，或直到無(wú)明顯可見(jiàn)組織塊。避免過(guò)度勻漿導(dǎo)致泡沫過(guò)多和蛋白熱變性/降解。
        *   勻漿結(jié)束后，用移液器吸取少量緩沖液沖洗探頭，將沖洗液合并入離心管。
    *   研磨法 (適用于少量或堅(jiān)硬組織)：
        *   在預(yù)冷的研缽中加入少量液氮和組織塊。
        *   快速研磨至細(xì)粉，在粉末融化前加入預(yù)冷裂解緩沖液。
        *   用刮刀將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷離心管。
        *   在冰上持續(xù)用研杵研磨離心管內(nèi)混合物數(shù)分鐘。
    *   超聲破碎法 (輔助方法，常用于難裂解組織/細(xì)胞核)：
        *   將樣本置于冰上。
        *   使用超聲破碎儀，設(shè)置適當(dāng)功率和占空比（如 30% 功率，超聲 2-3秒，停 5-10秒，重復(fù)數(shù)次）。
        *   嚴(yán)格控制時(shí)間并保持低溫，避免過(guò)熱。

4.  孵育裂解 (冰上)：
    *   將勻漿后的裂解液在冰上孵育15-30分鐘，讓裂解液中的去垢劑和離液劑充分作用，釋放胞內(nèi)蛋白。期間可每隔5-10分鐘輕柔渦旋振蕩一次。

5.  離心去除不溶物 (4°C)：
    *   將裂解液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中（注意不要超過(guò)離心管最大容量）。
    *   4°C, 高速離心 (通常為 12,000 - 16,000 x g)，離心 15 - 30分鐘。具體時(shí)間和轉(zhuǎn)速需根據(jù)樣本類型和目標(biāo)蛋白定位優(yōu)化（如核蛋白可能需要更高轉(zhuǎn)速或更長(zhǎng)時(shí)間）。
    *   目的：沉淀細(xì)胞碎片、未裂解細(xì)胞、細(xì)胞核（如果裂解液不強(qiáng)效）、不溶性膜蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)。

6.  收集上清 (含可溶性蛋白提取物)：
    *   極其小心地將上清液（澄清或稍渾濁的液體）吸取轉(zhuǎn)移到新的、預(yù)冷的離心管中。注意：
        *   切勿擾動(dòng)沉淀！吸取時(shí)槍頭保持在液面上層，避免接觸沉淀。
        *   如果沉淀不緊密或上清有漂浮物，可進(jìn)行二次離心（相同條件，5-10分鐘）以獲得更澄清的上清。
    *   此時(shí)收集的上清液即為含有可溶性總蛋白的組織提取物。

7.  蛋白定量 (BCA法或Bradford法推薦)：
    *   必須對(duì)提取物進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，以便在后續(xù)ELISA中上樣等量的總蛋白。
    *   使用標(biāo)準(zhǔn)方法（如BCA法或Bradford法），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。
    *   根據(jù)定量結(jié)果，可考慮用裂解緩沖液將提取物稀釋至所需的工作濃度（通常0.5-2 mg/mL），方便后續(xù)ELISA加樣。

8.  分裝與保存：
    *   將定量后的組織提取物迅速分裝到小體積（如50-100μL）的預(yù)冷離心管中。
    *   避免反復(fù)凍融！這是導(dǎo)致蛋白降解和活性喪失的主要原因。
    *   短期保存：置于冰上，并在當(dāng)天內(nèi)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
    *   長(zhǎng)期保存：立即放入-80°C超低溫冰箱。如需使用，取出后在冰上或4°C冰箱緩慢解凍，用后丟棄剩余部分，避免再次凍存。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題解決

1.  低溫！低溫！低溫！ (重中之重)：從取材到離心結(jié)束，所有步驟盡可能在冰上或4°C環(huán)境中進(jìn)行。高溫是蛋白酶激活和蛋白降解的最大敵人。預(yù)冷所有試劑、器具和離心機(jī)。
2.  速度！速度！速度！組織離體后，盡快完成清洗、分割、速凍或勻漿步驟。減少室溫暴露時(shí)間。
3.  蛋白酶/磷酸酶抑制劑：必須添加且足量、新鮮。抑制劑在裂解過(guò)程中會(huì)被消耗或降解。凍融或長(zhǎng)期保存的提取物在使用前應(yīng)考慮補(bǔ)加適量抑制劑。
4.  裂解緩沖液選擇：根據(jù)目標(biāo)蛋白特性（如膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白）選擇合適的裂解緩沖液成分（去垢劑種類、強(qiáng)度、是否含還原劑、離液劑等）。RIPA緩沖液裂解能力強(qiáng)，但可能破壞蛋白構(gòu)象和相互作用；NP-40緩沖液較溫和，適合胞漿蛋白和保留相互作用。務(wù)必查閱文獻(xiàn)或抗體說(shuō)明書推薦。
5.  組織與緩沖液比例： 比例過(guò)高（緩沖液少）導(dǎo)致裂解不充分、粘稠、蛋白濃度過(guò)高；比例過(guò)低（緩沖液多）導(dǎo)致蛋白濃度過(guò)低，可能低于ELISA檢測(cè)下限。需優(yōu)化。
6.  勻漿強(qiáng)度與時(shí)間：過(guò)度勻漿會(huì)產(chǎn)熱、起泡、導(dǎo)致蛋白變性和機(jī)械剪切破壞。以剛好裂解完全、無(wú)明顯組織塊為準(zhǔn)。
7.  離心條件：確保離心機(jī)預(yù)冷到4°C。轉(zhuǎn)速/時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致沉淀不徹底，雜質(zhì)污染上清，影響ELISA背景和準(zhǔn)確性；過(guò)度離心可能導(dǎo)致某些目標(biāo)蛋白共沉淀?yè)p失。
8.  避免污染：使用無(wú)菌或潔凈的耗材。操作時(shí)避免手、頭發(fā)、唾液等接觸樣本和試劑。勤換槍頭。
9.  分裝保存：絕對(duì)避免將同一份提取物反復(fù)凍融多次。分裝是保證每次使用新鮮樣本的關(guān)鍵。
10. 記錄：詳細(xì)記錄組織類型、重量、所用緩沖液類型/體積/批次、添加劑（抑制劑種類/濃度）、勻漿條件、離心條件、最終蛋白濃度、分裝情況、保存位置等。這對(duì)結(jié)果追溯和重復(fù)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。
11. 陽(yáng)性/陰性對(duì)照：在制備實(shí)驗(yàn)樣本的同時(shí)，制備已知表達(dá)目標(biāo)蛋白的陽(yáng)性組織樣本和可能不表達(dá)的陰性組織（或空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞）樣本的提取物，作為ELISA實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部質(zhì)控。
12. 樣本均一性：確保同一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的組織來(lái)源、處理方式、提取過(guò)程盡可能一致，減少組內(nèi)差異。

四、總結(jié)

高質(zhì)量的ELISA組織提取物是獲得可靠數(shù)據(jù)的首要保障。嚴(yán)格遵守“全程低溫、快速操作、充分抑制、適度裂解、徹底澄清、避免凍融、精確定量、詳細(xì)記錄”的原則，并針對(duì)具體實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化裂解條件和緩沖液配方，是成功制備的關(guān)鍵。投入足夠的時(shí)間和精力在樣本制備環(huán)節(jié)，將極大提高后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn)的成功率和數(shù)據(jù)可信度。