ELISA（酶聯免疫吸附試驗）是一種高靈敏度、高特異性的免疫學檢測技術，廣泛應用于生物醫學研究、臨床診斷和藥物開發等領域。實驗的成功與否，往往取決于前期的準備工作是否充分。本文將從樣本處理、試劑準備、設備校準、環境控制等多個維度，詳細解析ELISA實驗前的關鍵步驟，并針對新手常見問題提供解決方案，助您規避實驗風險，提升檢測效率。
血清/血漿：采集后需在1小時內分離，避免溶血（溶血會釋放血紅蛋白干擾檢測）。建議分裝后-80℃長期保存，避免反復凍融（≤3次）。
細胞培養上清：離心去除細胞碎片（推薦3000×g，10分鐘），立即檢測或分裝凍存。
組織勻漿液：需按比例加入裂解緩沖液（如RIPA），充分勻漿后離心取上清，注意避免泡沫產生。
??注意事項：
所有樣本需標注清晰（名稱、日期、濃度），避免混淆。
凍存樣本復融時，需在冰上緩慢解凍，避免高溫導致蛋白降解。
選擇與目標檢測物匹配的試劑盒（如夾心法、競爭法），核對試劑盒批號及有效期。
首次使用前，需檢查試劑是否齊全（包被板、標準品、檢測抗體、酶標物等），并確認無沉淀或渾濁。
標準品與檢測抗體：需提前1小時從-20℃取出，室溫平衡后按說明書梯度稀釋（建議使用低吸附離心管）。
洗滌液（Wash Buffer）：若為濃縮液，需用超純水準確稀釋（如10×濃縮液稀釋至1×），避免離子濃度偏差影響洗板效果。
??新手常見問題與解決：
問題1：標準曲線線性差，R2值低。
原因：稀釋誤差或標準品未完全溶解。
解決：使用校準過的移液器，混勻后靜置5分鐘再使用。
問題2：顯色底物（TMB）提前變色。
原因：酶標物污染或光照暴露。
解決：避光保存，分裝時使用新槍頭。
定期（每3個月）用天平校準移液器（尤其是微量移液器），誤差需≤2%。
吸液時保持垂直，慢吸慢放，避免氣泡。
酶標儀：開機后預熱15分鐘，用空白孔校準光路。
洗板機：檢查洗液管路是否通暢，確保每孔注液量一致。
??注意事項：
若手動洗板，需徹底拍干液體（傾斜45°輕叩吸水紙），避免交叉污染。
理想環境：室溫（22-25℃）、濕度＜60%。過高溫度會加速非特異性結合，濕度過高可能導致板條受潮。
孵育步驟需使用恒溫搖床，確保反應均勻。
實驗臺每日用75%乙醇擦拭，操作時佩戴手套并勤更換。
不同試劑瓶蓋避免交叉接觸，尤其是酶標物與底物。
對于首次檢測的樣本或新試劑盒，建議：
設置復孔：每個樣本至少2復孔，減少操作誤差。
陽性/陰性對照：驗證試劑盒有效性。
預判濃度范圍：通過文獻或預實驗調整樣本稀釋倍數，避免信號超出標準曲線范圍。
| 問題現象 | 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 顯色信號過弱 | 抗體效價低或孵育時間不足 | 延長一抗/二抗孵育時間（建議4℃過夜） |
| 背景值過高 | 洗板不徹底或封閉不充分 | 增加洗滌次數（建議5次），延長封閉時間（1-2小時） |
| 孔間重復性差 | 加樣速度不均或孔邊緣污染 | 使用多通道移液器，加樣時槍頭勿觸碰孔壁 |
| 標準曲線無梯度 | 標準品稀釋錯誤或酶標物失活 | 重新配制標準品，檢查酶標物活性 |
ELISA實驗前的準備是系統性工程，需從樣本、試劑、設備、環境四方面嚴格把控。對于新手，建議建立標準操作流程（SOP），并通過預實驗優化條件。上海森興研提供高靈敏度的ELISA試劑盒及專業技術支持服務，涵蓋實驗設計、問題診斷與數據分析，助您快速掌握實驗核心要點。
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